ALFA. Revista de Investigación en Ciencias Agronómicas y
Veterinarias
Enero-abril 2024 /
Volumen 8, Número 22
ISSN: 2664-0902 /
ISSN-L: 2664-0902
https://revistaalfa.org
pp. 69 – 83
Identificación de Bacterias Gram positivas en
muestras de leche cruda, obtenida por ordeño manual
Identification of
Gram-positive Bacteria in raw milk samples obtained by manual milking
Identificação de
bactérias Gram-positivas em amostras de leite cru obtidas por ordenha manual
Sara Melissa Yupangui Asanza1
syupangui2@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0009-0007-1033-3668
Jackson Daniel Moran Castillo1
bioq.moran@gmail.com
https://orcid.org/0009-0000-5252-1519
Carmen Elizabeth Silverio Calderón1
csilverio@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0000-0003-3587-4149
Silvana Gabriela
Manzanares Loaiza1
smanzanares@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-6078-9192
Alex Rodrigo Flores Acosta1
aflores@utmachala.edu.ec
https://orcid.org/0009-0009-2123-3341
Luis Eduardo Zuñiga-Moreno2
Izuniga@uagraria.educ.ec
https://orcid.org/0000-0002-1143-9022
1Universidad Técnica de
Machala. Machala, Ecuador
2Universidad Agraria del
Ecuador. Guayaquil, Ecuador
Artículo
recibido 21 de noviembre 2023 | Aceptado 22 de diciembre 2023 | Publicado 20 de
enero 2024
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dispositivo móvil o revisa este artículo en:
https://doi.org/10.33996/revistaalfa.v8i22.249
RESUMEN
La leche de vaca es
uno de los alimentos de mayor consumo por su abundante composición de
proteínas, ácidos grasos y micronutrientes esenciales. Sin embargo, estas
características, aunadas a las medidas higiénicas deficientes en el método de
obtención de este producto a través del ordeño manual; así como, su
recolección, almacenamiento y transporte, lo hacen susceptible a contaminación
por microorganismos y por tanto responsable de enfermedades a nivel
gastrointestinal. Objetivo.
Identificar bacterias Gram positivas presentes en leche cruda de vaca, obtenida
por ordeño manual, provenientes de cinco vaquerías ubicadas en el Cantón de
Chilla en la Provincia de El Oro, en Ecuador. Materiales y métodos. Por muestreo aleatorio se obtuvieron 20
muestras de leche, cada una de 150 ml, recolectadas del ordeño manual realizado
en cinco vaquerías. Una vez recolectadas las muestras, se aplicó la Normativa
INEN1 529-2:99 para el manejo y transporte. Asimismo, se realizó un análisis
microbiológico según los protocolos de las normativas NTE INEN9:2012 y NTE INEN
1529-5:2006, en el Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la
Universidad Técnica de Machala. Para la detección e identificación de las
bacterias Gram positivas se aplicaron métodos de dilución, caracterización,
prueba bioquímica enzimática y tinción de Gram. Resultados. Las características fisicoquímicas de densidad y pH,
de las muestras cumplieron con la Normativa. En todas las muestras, se observó
presencia de turbidez, gas y precipitado en las diluciones 1/10, 1/100 y
1/1000. Las pruebas enzimáticas y el cultivo microbiológico identificaron la
presencia de Staphylococcus aureus. Conclusiones.
El género Staphylococcus especie aureus fue la bacteria Gram positiva
predominante.
Palabras clave: Análisis microbiológico; Leche cruda; Bacterias Gram
positivas; Norma Técnica microbiológica; Staphylococcus aureus
ABSTRACT
Cow's milk is one of
the most consumed foods due to its abundant composition of proteins, fatty
acids and essential micronutrients. However, these characteristics, combined
with the poor hygienic measures in the method of obtaining this product through
manual milking; as well as its collection, storage and transportation, make it
susceptible to contamination by microorganisms and therefore responsible for
gastrointestinal diseases. Objective.
Identify Gram positive bacteria present in raw cow's milk, obtained by manual
milking, from five dairy farms located in the Canton of Chilla in the Province
of El Oro, in Ecuador. Materials and
methods. By random sampling, 20 milk samples were obtained, each of 150
ml, collected from manual milking carried out in five dairy farms. Once the
samples were collected, Regulation INEN1 529-2:99 was applied for handling and
transportation. Likewise, a microbiological analysis was carried out according
to the protocols of the NTE INEN9:2012 and NTE INEN 1529-5:2006 regulations, in
the Microbiology and Parasitology Laboratory of the Technical University of
Machala. For the detection and identification of Gram-positive bacteria,
dilution, characterization, enzymatic biochemical test and Gram staining
methods were applied. Results.
The physicochemical characteristics of density and pH of the samples complied
with the Regulations. In all the dairy farms, the presence of turbidity, gas
and precipitate was observed in the 1/10, 1/100 and 1/1000 dilutions. Enzymatic
tests and microbiological culture identified the presence of Staphylococcus
aureus. Conclusions. The genus
Staphylococcus species aureus was the predominant Gram positive bacteria.
Key words: Microbiological analysis; Raw milk; Gram positive bacteria;
Microbiological standards; Staphylococcus aureus
RESUMO
O leite de vaca é um
dos alimentos mais consumidos devido à sua abundante composição de proteínas,
ácidos graxos e micronutrientes essenciais. Contudo, estas características,
aliadas às fracas medidas higiénicas no método de obtenção deste produto
através da ordenha manual; bem como sua coleta, armazenamento e transporte,
tornam-no suscetível à contaminação por microrganismos e, portanto, responsável
por doenças gastrointestinais. Objetivo.
Identificar bactérias Gram positivas presentes no leite de vaca cru, obtido por
ordenha manual, de cinco fazendas leiteiras localizadas no Cantão de Chilla, na
Província de El Oro, no Equador. Materiais
e métodos. Por amostragem aleatória foram obtidas 20 amostras de leite,
de 150 ml cada, coletadas em ordenhas manuais realizadas em cinco propriedades
leiteiras. Uma vez coletadas as amostras, foi aplicada a Norma INEN1 529-2:99
para manuseio e transporte. Da mesma forma, foi realizada uma análise
microbiológica de acordo com os protocolos dos regulamentos NTE INEN9:2012 e
NTE INEN 1529-5:2006, no Laboratório de Microbiologia e Parasitologia da
Universidade Técnica de Machala. Para detecção e identificação de bactérias
Gram-positivas foram aplicados métodos de diluição, caracterização, teste
bioquímico enzimático e coloração de Gram. Resultados. As características físico-químicas de densidade e pH
das amostras atenderam ao Regulamento. Em todas as propriedades leiteiras foi
observada presença de turbidez, gases e precipitado nas diluições 1/10, 1/100 e
1/1000. Testes enzimáticos e cultura microbiológica identificaram a presença de
Staphylococcus aureus. Conclusões.
O gênero Staphylococcus espécie aureus foi a bactéria Gram positiva
predominante.
Palavras-Chave: Análise microbiológica; Leite cru; Bactérias Gram positivas; Padrões
microbiológicos; Staphylococcus aureus
INTRODUCCIÓN
Las Enfermedades
Transmitidas por Alimentos (ETA), son causadas por la ingestión de
microrganismos vivos perjudiciales para la salud, constituyen una de las causas
de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, principalmente en países cuyas
economías son más precarias. Estas enfermedades se pueden convertir en un
problema de salud pública, ya que generan un impacto negativo en la sociedad y
en los sistemas de atención de salud, ocasionando el deterioro de la calidad de
vida de la población, la productividad, el comercio y el turismo (1-3).
Las ETAs son
generalmente de carácter infeccioso o tóxico causadas por bacterias virus o
parásitos que penetran al organismo a través de los alimentos contaminados.
Producen diversas dolencias y enfermedades que pueden ir desde manifestaciones
gastrointestinales hasta el cáncer (2,4). La contaminación de los alimentos
puede darse en cualquier etapa del proceso desde la producción hasta el consumo
de los mismos. Se estima que cada año mueren 1,8 millones de personas debido a
enfermedades diarreicas atribuidas al consumo de agua o alimentos contaminados
con microorganismos patógenos (1, 5-7) En Ecuador el Ministerio de Salud Pública
a través de la Dirección Nacional de Vigilancia Epidemiológica, reportó 2207
casos por intoxicación alimentaria, para la semana 11 del año 2021, los cuales
en su mayoría fueron reportados en la Provincia de El Oro, con 1253 casos (8).
En consecuencia, es
importante vigilar la calidad alimentaria de la leche cruda de vaca; ya que,
por ser una sustancia rica en proteínas, lípidos y micronutrientes puede
convertirse en un caldo de cultivo idóneo para la multiplicación de
microrganismos (1,6). El control de este alimento se rige por la Norma Técnica
Ecuatoriana (9), la cual establece los requisitos que se deben cumplir, tanto
en la obtención, transporte y conservación; entendiendo por leche cruda como la
leche que no ha sufrido tratamiento térmico, salvo el de enfriamiento para su
conservación, ni ha tenido modificación alguna en su composición (6,9).
En esta investigación
para determinar los parámetros de calidad de la leche cruda, se empleó la Norma
INEN 0009:2012 predestinada a la pasteurización. Está norma es empleada
únicamente en leche fresca recién recolectada del ordeño, que no ha sido
sometida a un proceso térmico. Sin embargo, es permitido emplear enfriamiento
para conservar la leche de su descomposición. Dentro de los parámetros de
calidad que se pueden medir en la composición de la leche cruda, se destacan
los parámetros fisicoquímicos cualitativos como el color, aspecto y olor de la
leche, y también están los cuantitativos como temperatura, densidad, pH, acidez
y presencia de antibióticos (9, 10).
La leche cruda se
caracteriza por ser un producto homogéneo de olor y sabor agradable, de color
blanco opalescente, aspecto homogéneo, libre de bacterias y materias extrañas.
Los valores para la densidad a 20 deben oscilar entre 1028 y 1032 g/cc y el pH
entre 6,4 y 6,8. Asimismo, el límite aceptado de
concentración de Staphylococcus aureus es de 10 Unidades de Formación de
Colonias por ml de muestra (10 UFC/ml). Al cumplir con los parámetros
establecidos por la normativa (9) del Instituto Ecuatoriano de Normalización,
será aceptado como un producto de buena calidad para el consumo humano (11-13).
Con respecto a las
medidas que se deben cumplir, la leche debe ser almacenada y conservada a una
temperatura de 4°C, con el fin de controlar la proliferación del crecimiento
bacteriano. También el acarreo y transporte debe ser en vehículos adecuados,
preferiblemente refrigerados, sin tener interrupciones ni paradas innecesarias
(9,14,15). Otro aspecto importante que asegura la calidad alimenticia de la
leche es la aplicación de las medidas higiénicas en las vaquerías o lugares de
ordeño, se pueden mencionar: la limpieza y desinfección de la sala de
recolección, el uso de agua potable para la limpieza de equipos y utensilios,
esterilización de los recipientes para la recolección y almacenamiento, control
de la presencia de insectos como las moscas, uso de barreras físicas, tales
como mascarillas, gorros y guantes, por parte de los ordeñadores (14,15-19).
En este orden de ideas,
es importante destacar que la falta de higiene por parte del personal que
interviene en el ordeño, almacenamiento, transporte o comercialización de la
leche puede deteriorar su calidad higiénico sanitaria favoreciendo la
contaminación por la presencia de bacterias aerobias mesófilas, coliformes
totales y Staphylococcus aureus (14). Por consiguiente, la presencia de
microorganismos en la leche cruda además de contaminar y causar daños a nivel
de la salud, también provoca grandes pérdidas en las ganaderías lecheras
(3,5,20,21).
Las bacterias Gram
positivas como el género Staphylococcus son los patógenos con mayor índice de
ETAs. Los estafilococos, son bacterias de forma esférica, inmóviles, positivas
a las pruebas de coagulasa y catalasa, anaerobios facultativos que forman parte
de la microbiota natural de la piel, fosas nasales, del tracto urogenital y
también del tracto digestivo tanto en el ser humano como en los animales
(22,23). Se conoce que este género de bacterias presenta 45 especies y 21
subespecies los cuales se pueden clasificar de acuerdo a dos grupos, los que
pueden producir la enzima coagulasa: estafilococos coagulasa positivos (CoPs)
como por ejemplo S. aureus y los estafilococos coagulasa negativos (CoNS)
dentro de los cuales esta S. epidermidis, S saprophyticus, y S. Lugdunensis
(23-26). Comúnmente estas bacterias se cultivan en medios selectivos o
diferenciales a una temperatura de 35 a 37°C durante 18 a 24h para garantizar
un crecimiento óptimo (24-27).
Entre estos
microrganismos el Staphylococcus aureus es el que se presenta con mayor
prevalencia en la leche; alterando su composición descendiendo su pH entre 4.3
–y 4.5. Por tanto, es considerado como un agente patógeno causante de mastitis
bovina, infecciones superficiales y crónicas, y enfermedades gastrointestinales
en seres humanos (15, 22). Por esta razón el aislamiento e identificación del
S. aureus es de gran interés para la industria láctea en Ecuador, con el fin de
prevenir brotes de ETAs, ya que la detección a tiempo en el ambiente, materia
prima o producto terminado se convierte en la posibilidad de garantizar un
alimento seguro e higiénico y así evitar problemas de salud a la población
(20).
Cabe destacar, que en
este país la producción lechera representa una fuente de ingresos para casi 1,2
millones de personas. Esto indica que la industria láctea representa alrededor
del 4% del PIB Agroalimentario del país, teniendo un gran impacto económico y
un alto potencial de exportación (28,29). Entre los 299.000 productores de
leche ecuatorianos, un 80% son granjas pequeñas, familiares y solo un 20%
granjas medianas y grandes. Apenas 4% de los productores está tecnificado y
reporta alta productividad (20). Por tanto, es de importancia mantener la
calidad de la leche para asegurar el crecimiento de este sector económico.
Por lo antes planteado
la investigación se ejecutó en una muestra de cinco vaquerías ubicadas en el
cantón Chilla en la provincia de El Oro en Ecuador, y se trazó como objetivo
identificar bacterias patogénicas Gram positivas, presentes en la leche cruda
de vaca obtenida por ordeño manual; utilizando técnicas enzimáticas y
microbiológicas para su aislamiento e identificación.
MÉTODO
De acuerdo al objetivo
se clasifica como una investigación descriptiva con un diseño de campo,
longitudinal y contemporáneo. La población estuvo constituida por cinco
vaquerías ubicadas en el Cantón Chilla en la provincia de El Oro en Ecuador,
cada productora de leche se encuentra separada por una distancia mínima de 1000
metros, el total de vacas fue de 41 individuos. Por muestreo aleatorio se
obtuvieron 20 muestras de leche, cada una de 150 ml, estas muestras fueron
recolectadas del ordeño manual realizado en las vaquerías desde las 5:00 hasta
las 7:00 de la mañana, durante los meses de junio y julio, en el año 2023. Una
vez recolectadas las muestras, se aplicó la normativa INEN 1 529-2:99 (30) para
el manejo y transporte; bajo los mismos estándares, el procesamiento se realizó
en el Laboratorio de Microbiología y Parasitología, de la facultad de Ciencias
Químicas y de la Salud de la Universidad Técnica de Machala.
Para la detección e
identificación de las bacterias Gram positivas se aplicaron métodos de
dilución, caracterización, prueba bioquímica enzimática y tinción de Gram. Por
consiguiente, se utilizaron los materiales necesarios para la siembra y cultivo
de microorganismos; así como también, los equipos para la preparación de las
muestras, incubación, detección e identificación de microorganismos.
Procedimiento: Además de
los métodos y técnicas empleados para la recolección y transporte de la muestra
según la normativa INEN 1 529-2:99, se siguieron los protocolos para el
análisis microbiológico según normativa NTE INEN 9:2012 Y NTE INEN 1529-5:2006
(9, 30).
La recolección de las
muestras de leche cruda se hizo en recipientes estériles, debidamente
rotulados, los cuales se transportaron con temperaturas de 0 a 4Los medios de cultivo
utilizados fueron el Caldo Lactosa fabricado por MCDLAB y el Agar Manitol
Salado obtenido del Laboratorio Clínico “Dra. Cecilia Valverde”, los cuales
fueron preparados de acuerdo a los procedimientos estandarizados. Para la
siembra se utilizó la técnica de aislamiento por banco de cinco diluciones
sucesivas, a saber 1/10, 1/100/, 1/1000/, 1/10000 y 1/100000. Cada dilución se
sembró en caldo de cultivo de lactosa e incubados a 37
durante 24 horas (17).
Los procedimientos de identificación de los microorganismos fueron tres:
Aislamiento de colonias por agotamiento, en cajas de Petri; prueba bioquímica
de coagulasa y la tinción de Gram (23, 27,31)
DESARROLLO Y DISCUSIÓN
Las características
fisicoquímicas de las muestras de leche, de acuerdo a la normativa NTE INEN 9:2012, aluden
al pH y la densidad, estos resultados se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Características fisicoquímicas de las muestras
de leche cruda
|
pH |
||||
|
Vaquería |
Muestra 1 |
Muestra 2 |
Muestra 3 |
Muestra 4 |
|
1 |
6,42 |
6,50 |
6,63 |
6,70 |
|
2 |
6,56 |
6,59 |
6,41 |
6,78 |
|
3 |
6,49 |
6,56 |
6,53 |
6,68 |
|
4 |
6,43 |
6,42 |
6,59 |
6,47 |
|
5 |
6,62 |
6,47 |
6,51 |
6,69 |
|
Densidad relativa a 20 °C |
||||
|
Vaquería |
Muestra 1 |
Muestra 2 |
Muestra 3 |
Muestra 4 |
|
1 |
1,029 |
1,030 |
1,028 |
1,031 |
|
2 |
1,028 |
1,030 |
1,030 |
1,031 |
|
3 |
1,029 |
1,029 |
1,031 |
1,028 |
|
4 |
1,030 |
1,028 |
1,029 |
1,031 |
|
5 |
1,028 |
1,030 |
1,029 |
1,029 |
La Tabla 1 muestra la calidad fisicoquímica de
la leche cruda, con respecto al pH y densidad, todas las muestras en las
respectivas vaquerías presentan un pH entre 6,42 a 6,78 y una densidad entre
1,028 a 1,031. Lo que significa que la calidad fisicoquímica de la leche cruda
de vaca se encuentra dentro de los límites establecidos por la normativa NTE
INEN 9:2012. Al respecto, Brousett (32) y López y Barriga (33), mencionan que
cuando el pH de la leche está fuera de los rangos permitidos por la normativa,
es por efecto de contaminación microbiana, dado que estos microorganismos
transforman la lactosa en ácido láctico, bajando los valores del pH. También
puede ocurrir un cambio en el pH por mantener el producto a temperaturas
superiores a los 20°C. Esto no quiere decir que las muestras de leche no
pudieran estar contaminadas, sino que el tiempo de reproducción de las
bacterias no ha transcurrido.
Las características cualitativas de las
diluciones de las muestras de leche son el olor, la turbidez, la producción de
gas y la presencia de un precipitado. Así mismo el color, la consistencia y el
borde de las colonias son características empleadas para la identificación de
las colonias de microorganismos. Estas se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Características cualitativas por dilución de muestra
|
|
Vaquería 1 |
||||||||||||
|
|
Diluciones |
Colonias |
|||||||||||
|
|
|
Olor |
Turbidez |
Gas |
Precipitado |
Color |
Consistencia |
Borde |
|||||
|
|
1/10 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/100 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/1000 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/10000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|||||
|
|
1/100000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|||||
|
|
Vaquería 2 |
||||||||||||
|
|
Diluciones |
Colonias |
|||||||||||
|
|
|
Olor |
Turbidez |
Gas |
Precipitado |
Color |
Consistencia |
Borde |
|||||
|
|
1/10 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/100 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/1000 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/10000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|||||
|
|
1/100000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|||||
|
|
Vaquería 3 |
||||||||||||
|
|
Diluciones |
Colonias |
|||||||||||
|
|
|
Color |
Turbidez |
Gas |
Precipitado |
Color |
Consistencia |
Borde |
|||||
|
|
1/10 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/100 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/1000 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/10000 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|||||
|
|
1/100000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|||||
|
Vaquería 4 |
|
||||||||||||
|
Diluciones |
Colonias |
|
|||||||||||
|
|
Olor |
Turbidez |
Gas |
Precipitado |
Color |
Consistencia |
Borde |
|
|||||
|
1/10 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/100 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/1000 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/10000 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/100000 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
Vaquería 5 |
|
||||||||||||
|
Diluciones |
Colonias |
|
|||||||||||
|
|
Olor |
Turbidez |
Gas |
Precipitado |
Color |
Consistencia |
Borde |
|
|||||
|
1/10 |
Característico |
Alto |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/100 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/1000 |
Característico |
Medio |
Presencia |
Positivo |
Amarillo con halo amarillo |
Untuoso |
Liso |
|
|||||
|
1/10000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|
|||||
|
1/100000 |
Característico |
Bajo |
Ausencia |
Negativo |
Sin datos |
Sin datos |
Sin datos |
|
|||||
En la Tabla 2 se muestra que en todas las
vaquerías se observó presencia de turbidez, gas y precipitado en las diluciones
1/10, 1/100 y 1/1000; así mismo, en sus colonias presentaron un color amarillo
con halo de este color, consistencia untuosa y borde liso. De forma específica
en las vaquerías 1, 2 y 5, fue positiva la presencia de microorganismos en las
diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000, y negativa en las restantes. Las muestras de
la vaquería 4, fueron positivas a la presencia de microorganismos hasta la
dilución 1/10000 y la vaquería 3 resultó positivo en todas las diluciones desde
1/10 hasta 1/100000. Esto significa que existe mayor concentración de
microrganismos en las muestras de leche cruda proveniente de la vaquería 3, ya
que se observó el desarrollo de las colonias en todas las diluciones. Sin embargo,
estos resultados no son concluyentes con el tipo de microorganismo.
En este orden de ideas Ramírez et al. (34)
refieren que los medios de cultivos tanto líquidos como sólidos, son un
conjunto de nutrientes necesarios para el desarrollo de microorganismos. De
acuerdo a la concentración del inóculo, el desarrollo de las bacterias va
aumentar o disminuir de manera directamente proporcional; a mayor concentración
mayor será el crecimiento bacteriano y si la concentración es baja tendrá un
menor crecimiento. Las diluciones para este estudio se realizaron en caldo
lactosa, las características que deberían presentar son turbidez, precipitado y
gas, para indicar el crecimiento de microorganismos, pero no se puede
especificar la bacteria que se está desarrollando ya que es una prueba presuntiva
(Ver Figura 1A). En la Figura 1B el tubo presenta el líquido transparente libre
de crecimiento bacteriano.
Figura 1. Características
cualitativas de las diluciones 1/10 y 1/100000 en la vaquería 2
Una vez realizadas las lecturas de las
características cualitativas en las cinco diluciones por cada muestra, se
procedió al conteo de colonias aisladas en medio de cultivo agar manitol
salado, el cual se utilizó como un medio selectivo para el aislamiento de
estafilococos patógenos, especialmente el Staphylococcus aureus, los resultados
en la Figura 2.
Figura 2. Desarrollo de las
Unidades de Formación de Colonias
La siembra se realizó por duplicado a partir de
las cinco diluciones para las 20 muestras de leche. En la Figura 2 se observa
que las muestras provenientes de la vaquería 4 presentan mayor cantidad de
Unidades Formadoras de Colonias de S. aureus por mililitro de muestra (UFC/ml).
En la dilución 1/10 el recuento de UFC fue de 98 y en las vaquerías 1, 2, 3 y 5
no sobrepasaron de las 45 UFC. En la dilución 1/100000, las muestras de la
vaquería 4 fueron las únicas en las cuales aparecieron 38 colonias, esto en
comparación con las muestras provenientes de las otras vaquerías, las cuales no
desarrollaron colonias en esa dilución. El recuento de organismos mesofílicos
es una medida de las condiciones de higiene en la producción de leche, donde el
valor de 10.000 UFC/ml es considerado para indicar que la leche es de buena
calidad, por encima de estos valores no es recomendable el procesamiento ni el
consumo del producto (9).
Para el cultivo de los microorganismos se
prepararon suspensiones con solución salina estéril. Se realizó la siembra por
estriado en agar manitol salado, como el medio selectivo y diferencial para el
aislamiento de Staphylococcus aureus, las cápsulas de Petri fueron incubadas a
27 durante 24 horas. En la figura 3 se evidencian
las colonias de color amarillo en el lado A y el agar limpio sin colonias en el
lado B. Al respecto, Durán Vila et al. (35), reportan que cuando existe el
desarrollo de colonias de S. aureus, es porque este tipo de bacterias son
fermentadoras del manitol y por ende va a producir acido en el medio de
cultivo, permitiendo la formación del halo de color amarillo alrededor de las
colonias.
Figura 3. Siembra en agar
manitol. A: desarrollo de colonias de S. aureus B: Ausencia
El recuento elevado de S. aureus en las muestras
de la vaquería 4 pudo tener diversos factores contaminantes como la presencia
de lodo, heces del ganado, inadecuado empleo del equipo de bioseguridad por
parte de los ordeñadores, calidad del agua para el lavado de utensilios y
desinfección de la ubre bovina; sin embargo, no se logró determinar cuál o
cuáles fueron los causantes. De acuerdo a la normativa NTE INEN 9, el límite
aceptado de concentración de S. aureus es de 10 UFC/ml, por consiguiente, las
muestras de leche de las vaquerías 4 y 1 no son aptas para su procesamiento y
consumo.
Estos resultados coinciden con los reportados
por la investigación de Saltos Solórzano et al. (36) en la cual el análisis de las
muestras de leche fue positivo para Staphylococcus aureus, con un conteo de
colonias entre 120 y 13 UFC/ml, en las diferentes diluciones para la siembra.
Concluyendo que todas las muestras estuvieron fuera del rango de aceptación del
producto de acuerdo a la Norma NTE INEN 15. Para reducir la contaminación por
S. aureus los investigadores implementaron Procedimientos Operacionales
Estandarizados (POE) y Procedimientos Operacionales Estandarizados de
Sanitación (POES) como prácticas para prevenir la contaminación de la leche,
estos redujeron notoriamente la presencia de Staphylococcus aureus.
Asimismo,
diferentes investigaciones de análisis microbiológico de leche cruda obtenida
por ordeño manual, como las de Martínez-Vasallo et al., (18) Albuja Landi et
al., (19), Pacha et al., (24) y Jaramillo Colorado et al. (37), coinciden en
reportar la presencia de Staphylococcus aureus, superiores a 10 UFC/ml en las
primeras tres diluciones de las muestras. Como causas de la contaminación por
este microorganismo mencionan las malas prácticas de higiene durante la rutina
de ordeño, uso inadecuado de barreras físicas como la mascarilla y guantes, y
carencias en la desinfección en el lugar de ordeño.
A continuación, se reporta el resultado del
tamaño desarrollado por las colonias de S. aureus en las diferentes diluciones
de las muestras como otra característica cuantitativa, Figura 4
Figura 4. Tamaño de las colonias
de S. aureus.
La Figura 4 permite determinar que las colonias
de Staphylococcus aureus presentaron ciertas diferencias en cuanto al tamaño,
el máximo fue de 0,35 mm y mínimo de 0,075 mm. El tamaño de las colonias puede
ser afectado por el tiempo de incubación y la concentración bacteriana en la
siembra (23, 26). Es decir que, si el asa de platino no estuvo tan cargada de
muestra, al momento de hacer el estriado en el medio de cultivo no iba a crecer
de la misma manera que una siembra bien cargada. Con el objetivo de confirmar
el tipo de especie de Staphylococcus aislado en el en el medio de cultivo, se
realizó la prueba de coagulasa (17, 23), los resultados se pueden observar en
la Figura 5.
Figura 5. Prueba Bioquímica de Coagulasa
La Figura 5 evidencia
resultados positivos a la prueba de Coagulasa, en todas las muestras, las
colonias aisladas en agar manitol fueron características de Staphylococcus
aureus. Al respecto Pasachova Garzón et al., (22) en su investigación mencionan
que para confirmar el tipo de Staphylococcus que creció en agar manitol, se
debe realizar la prueba bioquímica de coagulasa, la cual con un resultado
positivo se comprueba que la bacteria aislada pertenece a la genero
Staphylococcus y a la especie aureus. Esto se debe a la producción de la enzima
estafilocoagulasa que actúa como un agente activo en la coagulación que
convierte el fibrinógeno en fibrina. Esta prueba distingue la bacteria S.
aureus de las otras especies como lo son la S. epidermidis, S. lugdunensis y S.
saprophyticus ya que estas bacterias al no producir esta enzima, son
denominadas estafilococos coagulasa negativos.
Finalmente, se realizó
la tinción de Gram para corroborar el género y especie de la bacteria, resultados
que se ilustran en la Figura 6.
Figura 6.
La Figura 6 muestra una
tinción de Gram positiva, ya que las bacterias retuvieron el color violeta. La
parte A es una vista microscópica con un aumento de 400X y la parte B de 1000X.
Está técnica permitió confirmar la presencia de Staphylococcus aureus en las
muestras de estudio. Al respecto Cervantes-García et al. (25) indican que si
las bacterias conservan la coloración cristal violeta se denominan Gram
positivas y si la pierden se denominan Gram negativas; la tinción de Gram se
debe realizar con cultivos frescos no mayor a las 24 h, puesto que un cultivo
pasado este tiempo hace que las bacterias pierdan la capacidad de retener el
colorante primario.
De acuerdo a los
resultados obtenidos las muestras de la leche cruda presentan recuentos
elevados de S. aureus, por lo tanto, no cumplen con la normativa NTE INEN9:2015
(38). El consumo de este producto puede provocar daños en la salud del consumidor.
Al respecto, Jaramillo Colorado et al (37) manifiestan que el S. aureus es una
bacteria patogénica causante de intoxicación alimentaria y al consumir una
leche contaminada por este tipo de bacteria traerá consigo problemas
gastrointestinales manifestados como dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea
y deshidratación en casos severos. Mientras que en casos más graves se puede
presentar síntomas tales como cefalea y colapso intestinal.
CONCLUSIÓN
Se identificó en las
muestras de leche cruda obtenida por ordeño manual, provenientes de las
vaquerías del Cantón Chilla la presencia de la bacteria Stapylococcus aureus de
forma predominante con respecto a otras bacterias. En una de las vaquerías se
obtuvo una carga microbiana muy elevada, lo que indica que la leche no tiene
buena calidad higiénica en relación a las Normas Técnicas ecuatorianas. Las
causas de la contaminación de la leche cruda de vaca con S. aureus pueden ser
las inadecuadas prácticas de ordeño y las escasas condiciones higiénicas en los
ambientes de las cinco unidades productoras de leche y en los utensilios de
recolección y transporte.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran que
no existe conflicto de intereses para la publicación del presente artículo
científico.
FINANCIAMIENTO
Los autores declaran que
no recibieron financiamiento
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